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DAP-seq實驗用到的蛋白表達系統是promega公司的TNTSP6 Wheat Germ Master Mix表達系統（promega L326A），一種體外真核蛋白表達系統。體外表達用到的載體為promega公司的pFN19K HaloTag? T7 SP6 Flexi? Vector（promegaG184A）。本篇為大家介紹一套超高性價比的載體構建方案：
Part
1
線性化載體
此步驟是通過PCR擴增來線性化載體，PCR后需要切膠回收降低假陽性。
P-T7sp6-R（線性化反向引物）：cgcgttatcgctctgaaagtac
P-T7sp6-F（線性化正向引物）：aaacgaattcgggctcggtac
配置反應體系：
2×CisPfu HiFi PCR mix （E0102S） | 10 μL |
pFN19K模板（免費索取） | 1 μL |
正向引物（10 μM） | 0.5 μL |
反向引物（10 μM） | 0.5 μL |
water to 20 μL |
反應條件：
預變性 98 ℃ | 2 min |
PCR 反應 98 ℃ | 10 s |
退火56℃ | 30 s |
延伸 68℃ | 1 min 25個循環 |
68 ℃ | 5 min |
電泳切膠回收，片段大小4000左右。
Part
2
基因克隆
正向引物設計：ttCAGAGCGATAACGCG+ 基因ATG開始上游引物
反向引物設計：cgAGCCCGAATTCGTTT+基因下游引物TAA結束（反向互補）
配置反應體系：
2×CisPfu HiFi PCR mix （E0102S） | 10 μL |
轉錄因子模板 | 1 μL |
正向引物（10 μM） | 0.5 μL |
反向引物（10 μM） | 0.5 μL |
water to 20 μL |
反應條件：
預變性 98 ℃ | 2 min |
PCR 反應 98 ℃ | 10 s |
退火(Tm-3)℃ | 30 s |
延伸 68℃ | 1 min 30個循環 |
68 ℃ | 5 min |
電泳切膠回收片段。
Part
3
連接轉化
重組反應配制反應體系如下：
Fast DNA Assembly Mix | 5 μL |
轉錄因子片段 | 10 ng |
線性化載體 | 10 ng |
滅菌水 up to 10 μL |
反應溫度為 50℃ 5min。
將克隆用的化學感受態細胞置于冰上解凍。
取 5 - 10 μL 連接產物加入到 100 μL 感受態細胞中，輕彈管壁混勻 ( 請勿振蕩混勻 )，冰上靜置 30 min。注意：連接產物轉化體積最多不應超過所用感受態細胞體積的 1/10。
42℃水浴熱激 60 sec 后，立即置于冰上冷卻2 min。
加入900 μL SOC 或 LB 液體培養基 ( 不添加抗生素 )，37℃搖菌 1 h ( 轉速 200 rpm)。
10000 rpm 離心 1min，棄掉900 μL 上清。用剩余培養基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有卡那霉素抗性的平板上輕輕涂勻。
37℃培養箱中倒置培養 12 - 16 h。
陽性克隆測序鑒定，提取質粒。
Part
4
附錄
1 測序引物pT7SP6-cx-F：tgcaaggctgtggacatcgg
2 pFN19K模板索取登記電話：13826269811
3 原始載體序列信息
Ggatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggtacgatttaggtgacactatagaataaggagaattcatcatggcagaaatcggtactggctttccattcgacccccattatgtggaagtcctgggcgagcgcatgcactacgtcgatgttggtccgcgcgatggcacccctgtgctgttcctgcacggtaacccgacctcctcctacgtgtggcgcaacatcatcccgcatgttgcaccgacccatcgctgcattgctccagacctgatcggtatgggcaaatccgacaaaccagacctgggttatttcttcgacgaccacgtccgcttcatggatgccttcatcgaagccctgggtctggaagaggtcgtcctggtcattcacgactggggctccgctctgggtttccactgggccaagcgcaatccagagcgcgtcaaaggtattgcatttatggagttcatccgccctatcccgacctgggacgaatggccagaatttgcccgcgagaccttccaggccttccgcaccaccgacgtcggccgcaagctgatcatcgatcagaacgtttttatcgagggtacgctgccgatgggtgtcgtccgcccgctgactgaagtcgagatggaccattaccgcgagccgttcctgaatcctgttgaccgcgagccactgtggcgcttcccaaacgagctgccaatcgccggtgagccagcgaacatcgtcgcgctggtcgaagaatacatggactggctgcaccagtcccctgtcccgaagctgctgttctggggcaccccaggcgttctgatcccaccggccgaagccgctcgcctggccaaaagcctgcctaactgcaaggctgtggacatcggcccgggtctgaatctgctgcaagaagacaacccggacctgatcggcagcgagatcgcgcgctggctgtcgacgctcgagatttccggcgagccaaccactgaggatctgtactttcagagcgataacgcg（載體擴增R引物位置） atcgccatggaataagtaaggaatccacatggcacaggttatcaacacgtttgacggggttgcggattatcttcagacatatcataagctacctgataattacattacaaaatcagaagcacaagccctcggctgggtggcatcaaaagggaaccttgcagacgtcgctccggggaaaagcatcggcggagacatcttctcaaacagggaaggcaaactcccgggcaaaagcggacgaacatggcgtgaagcggatattaactatacatcaggcttcagaaattcagaccggattctttactcaagcgactggctgatttacaaaacaacggaccattatcagacctttacaaaaatcagataatgttt（載體擴增F引物位置）aaacgaattcgggctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagctgatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggttcgcttgctgtccataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgctttctctttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatccggggtcagcaccgtttctgcggactggctttctacgtgttccgcttcctttagcagcccttgcgccctgagtgcttgcggcagcgtgagcttcaaaagaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgacggtcgtttcgcatgcttgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgcactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgtatgccggatggtgaggatctcgtcgtgactcatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaaccggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatttcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttatagtccggaaatacaggaacgcacgctggatggcccttcgctgggatggtgaaaccatgaaaaatggcagcttcagtggattaagtgggggtaatgtggcctgtaccctctggttgcataggtattcatacggttaaaatttatcaggcgcgattgcggcagtttttcgggtggtttgttgccatttttacctgtctgctgccgtgatcgcgctgaacgcgttttagcggtgcgtacaattaagggattatggtaaatccacttactgtctgccctcgtagccatcgagataaaccgcagtactccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatcttttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactcttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcat
